Принципы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

Существуют прямые и косвенные методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

С помощью прямых методов лабораторной диагностики в биологическом материале (крови, моче и проч.) выявляются микроорганизмы, их антигены или ДНК.

Прямые методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний:

• бактериоскопия (микроскопия) – выявление возбудителя под микроскопом
• прямая или косвенная иммунофлюоресценция антигенов – под микроскопом видно свечение на поверхности возбудителя, который был предварительно обработан специальными веществами
• выявление ДНК – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)
• бактериологический метод — выделение возбудителя на питательной среде (бактерии) или культуре клеток (вирусы).

Косвенные методы диагностики лабораторной диагностики инфекционных заболеваний

Типичными косвенными методами диагностики лабораторной диагностики инфекционных заболеваний являются серологические исследования, в основе которых лежит определение специфических к возбудителю инфекции антител:

• иммуноглобулинов М (IgМ),
• иммуноглобулинов G (IgG),
• иммуноглобулинов А (IgА).

Для сравнения качества, надежности и достоверности различныхметодик используют понятие диагностической специфичности и чувствительности, объективности и субъективности.

Чувствительность — вероятность получения положительного результата исследования при имеющейся болезни (результат одинаковый с истинным). Чем выше чувствительность метода, тем больше шансов диагностировать болезнь с первого раза, но и им чаще можно получить ложноположительный результат у здорового человека (гипердиагностика).

Специфичность — вероятность получения отрицательного результата при отсутствии болезни. Чем выше специфичность метода, тем чаще можно получить ложнонегативный результат у больного человека (гиподиагностика). В рутинной практике под специфичностью преимущественно понимают степень соответствия между полученным результатом и истинным состоянием. Чем больше специфичность, тем больше уверенность в том, что обнаружен истинный, именно тот показатель, который исследовали, например, антиген или антитело конкретного возбудителя.

Высокая чувствительность метода позволяет выявить болезнь, а высокая специфичность — подтвердить правильность результата.

Субъективность — восприятие результатов анализов и непосредственно человеком, без использования аналитического оборудования. Субъективные методы исследования (микроскопия, неаппаратные серологические исследования) преимущественно имеют два варианта результатов — положительный и отрицательный. Точность ответа в таких случаях сильно зависит от опытности и знаний лаборанта.

Объективность — восприятие результатов анализов посредством аналитического оборудования, например ИФА-анализатора, спектрофотометра, различных датчиков. Такие методики более точные, результаты представляются в числовом диапазоне.

Культуральный метод (выращивание бактерий на питательных средах – бактериологический посев мочи, крови) обеспечивает высокую специфичность анализа, однако имеет ряд недостатков:

1. трудоемкость
2. продолжительность выполнения исследования (в течение 1-5 и более суток)
3. большие материальные затраты и привлечения высококвалифицированных специалистов

Бактериоскопический метод (световая микроскопия) имеет низкую специфичность и чувствительность по сравнению с прямой иммунофлуоресценцией и ПЦР.

Иммунофлюоресцентные методики (прямая имунофлюоресценция — ПИФ, непрямая иммунофлюоресценция — НПИФ) основаны на феномене свечения специального красителя при люминесцентной микроскопии.

Методы ПИФ и НПИФ похожи, и отличаются только техникой обработки препаратов реактивами. При методе ПИФ образец биоматериала обрабатывается меченными флюорохромом антителами сразу, за один раз. При методе НПИФ постановка реакции проводится в два этапа: сначала препарат обрабатывают специфическими немечеными антителами, в результате чего образуется комплекс антиген-антитело, с которым на втором этапе реагируют меченные флюорохромом антитела. Чувствительность и специфичность этих разновидностей флюоресцентного метода не отличаются и составляют 80-95%.

Методом ПИФ предусмотрена диагностика хламидиоза, уреаплазмоза, микоплазмоза, методом НПИФ — вируса простого герпеса, цитомегаловируса, гонореи, трихомониаза и других инфекций. Выполнение этих методик предусматривает специальную подготовку как врача, который должен правильно провести забор материала так и врача-лаборанта, который должен правильно выполнить обработку материала и оценить результат с минимальной субъективностью.

Важные понятия серодиагностики

Титр антител — полуколичественное выражение содержания неспецифических антител в сыворотке крови в виде дроби, где показана наибольшая степень разведения исследуемой сыворотки, при которой анализ дает положительный результат.

Так, обычно, используется серия последовательных двукратных разведений, значение титра выходят кратными 2: 1:2, 1:4, 1:8 … до 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Чем больше знаменатель дроби, тем выше концентрация антител в пробе.

Современная постановка иммуноферментного анализа проводится на анализаторах оптической плотности пробы, где вместо титра используют количественный показатель, выраженный в международных единицах (MO, IU), или единицах те оптической плотности (ОП), иммуноферментных единицах (IEU) или в нанограммах на литр.

Традиционно под титром антител понимают их количество в сыворотке крови независимо от единиц измерения.

Критическая оптическая плотность (контрольный уровень оптической плотности) — величина, которая рассчитывается по специальным формулам выполнения контрольных проб каждой тест-системы. Согласно значению оптической плотности критической определяется степень положительности исследуемых проб.

Результат исследования считается положительным, если он превышает значения оптической плотности критической на определенную величину, которая зависит от вида тест-системы. Все расчеты ведутся в лаборатории, после чего выдается значение результата – положительный, сомнительный, отрицательный и цифровой показатель пробы. На практике критическую оптическую плотность часто называют «нормой» и записывают «N =…».

Серая зона — это диапазон низких концентраций специфических антител, от уровня критической величины к положительному результату анализа. В серую зону с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы.

Результаты анализа, соответствующие серой зоне, преимущественно обозначаются как сомнительные, и не могут быть однозначно интерпретированы. Поэтому, для уточнения результата, необходимо повторить исследование с новым образцом сыворотки, прикрепленные через 1-2 недели, или провести дообследование по другой методике, в частности ПИФ, ПЦР.