Применение эмбриональных стволовых клеток

Эмбриональные стволовые клетки как инструмент для исследований. Эмбриональные стволовые клетки, как человека, так и мыши — мощный инструмент для базовых и прикладных аспектов биологии клетки. Эмбриональные стволовые клетки мыши используются для изучения функции генов у животных в це­лом. Анализ «нокаутных» эмбриональных стволовых клетки иногда высокоэффективен для выявления ключе­вых генов и их отсутствия, но не позволяет изучить тонкие механизмы функцио­нирования продуктов генов в определенном контексте.

Удивляет то, что в боль­шинстве работ по изучению мышиных эмбриональных стволовых клеток не рассматриваются вопросы диффе­ренцировки In vitro, в то время как явления на клеточном уровне могут быть бо­лее доступны для анализа.

Как только техника направленных генетических модификаций эмбриональными стволовыми клетками человека станет доступной, появится большая вероятность того, что система эмбриональных стволовых клеток станет мощным инструментом функциональной геномики человека. Доступным анали­зу станет влияние делеций или мутаций специфических генов на клеточную диф­ференцировку и функцию In vitro, а также изучение функции генов в жизнедея­тельности клетки. Возникает возможность создания моделей заболеваний и про­ведение лекарственного скрининга на точных моделях болезней человека, а не на животных субстратах.

Применение стволовых клеток в трансплантационной терапии

Потенциальные возможности эмбриональных стволовых клеток человека как источника для использования в трансплантационной терапии привлекают к ним большое внимание. Отдельные линии эмбриональных стволовых клеток бессмертны и плюрипотентны, они могут стать источником для многих типов клеток организма. В результате развития болезней в клетках возникают инволютивные дегенератив­ные процессы, которые невозможно остановить с помощью современной терапии. В ряде случаев только трансплантация может быть эффективным терапевтичес­ким средством, но существует постоянный недостаток тканей, что резко ограни­чивает этот подход.

В экспериментах на мышах концептуально доказана возможность применения тканей, полученных из эмбриональных стволовых клеток для лечения диабета, болезни Паркинсона, инфаркта миокарда, травм позвоночника и серьезных иммунологичес­ких нарушений.

Эксперименты в этом направлении ведутся на протяжении примерно 5 лет и итог их обнадеживающий. Однако на пути внедрения этих ме­тодов в клиническую практику стоят серьезные проблемы.

Первая проблема — получение в достаточном количестве клеток нужного типа в чистой форме. Для большинства типов клеток, которые представляют клинический интерес, это пока недостижимо. В некоторых направлениях предшественники нервной системы/чи­стые популяции клеток-предшественников можно получить стандартным методом из культур эмбриональных стволовых клеток, размноженных количественно и дифференцировавших в зрелые клетки.

Вторая проблема, которую следует решить: какие именно типы клеток лучше использовать для лечения конкретного заболевания? Например, что лучше для лечения нейродегенеративных болезней: пересаживать клетку-предшественник нервной системы или полностью зрелые нейроны? В одних случаях простая инъ­екция клеток или прививка клеток дадут удовлетворительный результат, а в дру­гих — трансплантат необходимо заключить в какую-то вспомогательную форму для его эффективного действия.

Третья проблема — отторжение трансплантата иммунной системы донора. Воп­рос сложный и в нем много неизвестных. Неясно, как на эмбриональные клетки или их производные отреагирует иммунная система. Некоторые ткани более при­емлемы для системы иммунитета, другие более уязвимы под ее воздействием. Та­ким образом, некоторые ткани, полученные из эмбриональных стволовых клеток, подвержены воздействию иммунных реакций.

Рассматривается несколько вариантов решения этой проблемы. Одни исследо­ватели полагают, что будут созданы крупные банки стволовых клеток, составляю­щие огромный массив для поиска гистосовместимости. Ряд иммунологов счита­ет, что в ближайшие годы управление активностью Т-клеток достигнет такого уров­ня, что проблема станет управляемой. Некоторые исследователи считают пер­спективным использование комбинированного трансплантата, который заменит кроветворную и лимфоидную системы пациента клетками, полученными из эмбриональных стволовых клеток, после чего можно пересаживать трансплантат необходимого типа клеток.

В одном из последних исследований высказано предположение о том, что эмб­риональные клетки могут сами вызывать состояние иммунной толерантности у необлученного реципиента. Особое внимание привлекло терапевтическое клонирование — процедура, объединяющая клонирование путем преобразования ядер соматических клеток с помощью эмбрионально-стволовой технологии для создания стволовых клеток, которые точно соответствуют клеткам пациента. Возможность терапевтического клонирования была доказана в опытах на мы­шах.

Суть опыта заключалась в следующем. Ядра соматических клеток мышей с иммунодефицитом Raag 2 (-/-) были пересажены в яйцеклетки, из которых удалялись ядра. Полученные в результате клонированные бластоцисты использо­вались для продуцирования линий эмбриональных стволовых клеток. Генетический дефект в эмбриональных стволовых клетках был исправлен с использованием гомологич­ной рекомбинации для замены дефект­ного аллеля Raag 2. Кроветворные ство­ловые клетки, полученные из таких эмбриональных стволовых клеток, вводили мышам с дефектом Raag 2 (-/-) и они дифференцировались в миелоидные и лимфоидные линии ре­ципиента, вследствие чего возобновлял­ся синтез иммуноглобулинов.

Слияние ядра соматической клетки с энуклеированной яйцеклеткой с целью «терапевтического клонирования»

К прак­тическим трудностям при терапевтичес­ком клонировании относятся недоста­точное количество яйцеклеток и дли­тельный срок подготовки, а также воп­росы безопасности, связанные с известными случаями разнообразных дефектов раз­вития у клонированных животных.

Эксперименты, в основе которых лежит цель понимания основных механизмов перепрограммирования клеток, дадут важные результаты, которые позволят оп­ределить молекулярные характеристики плюрипотентного состояния и приспо­собляемости зрелых стволовых клеток.

Таким образом, линии плюрипотентных клеток могут быть получены из эмб­риона человека до его имплантации. Из эмбриональных стволовых клеток человека в культуре In vitro можно получить большое количество дифференцированных типов клеток с использова­нием различных методов дифференцировки. Сейчас стоит задача усовершенство­вать возможность управления культурами эмбриональных стволовых клеток человека In vitro, облегчить фун­даментальные и прикладные исследования функционирования генов и разработ­ку новых лекарств, а также производство дифференцированных клеток в большом количестве и в чистой форме для доклинических исследований при лечении раз­личных заболеваний до проведения клинических испытаний.

Перспективы изучения эмбриональных стволовых клеток человека.

Большинство способов получения эмбриональные стволовые клетки человека требуют выращивания и манипуляций относительно чистых популяций стволовых клеток и доступности методов получения и выделения из них специ­фических типов дифференцированных клеток.

До настоящего времени нет сообщений о значительном росте, эффективном клонировании или генетических манипуляций с эмбриональными стволовыми клетками или эмбриональными половыми клетками человека. Важ­ным является определение факторов, облегчающих рост и угнетающих дифферен­цировку эмбриональных стволовых клеток человека. Отказ от требований к питательному слою может быть не­обходим для проведения отдельных экспериментов и получения клеток для транс­плантации. Несмотря на то, что в течение многих лет в качестве питательного слоя используются мышиные фибробласты, до сих пор неизвестны молекулярные ме­ханизмы, обеспечивающие эту способность фибробластов. Установлено, что пита­тельный (фидерный) эффект в отношении плюрипотентных клеток приматов не воспроизводится как супернатантом клеток, так и внеклеточным матриксом, ко­торый они секретируют в монослой. Возможно, секретируемые факторы действу­ют совместно с матриксом либо действующие факторы связаны с мембраной, вы­соко нестабильны или теряются.

Эффективность клонирования и устойчивость к диссоциации на отдельные клетки у плюрипотентных клеток приматов остает­ся низкой даже в присутствии мышиного фидерного слоя. Складывается впечат­ление, что юкстакриновые факторы, возможно, фиксированные на мембране лиганды, связывающиеся с рецепторами на соседних аутологичных клетках, являют­ся критическими для выживания и роста эмбриональных стволовых клеток человека. Установлено несколько потенциальных позитивных регуляторов роста эмбриональных стволовых клеток, но ни один из них не очищен до гомогенности и не клонирован. Похоже, что эти факторы не родственны LIF и могут, в конце концов, оказаться важными для поддержания эмбриональных стволовых клеток человека.

Как в случаях с эмбриональными стволовыми клетками мыши, так и эмбриональные стволовые клетки человека определенные типы диффе­ренцированных клеток угнетают продолжение роста стволовых клеток. Методика селекции стволовых клеток, при которой определяемый маркер под контролем специфического промотора стволовых клеток (например, Oct-4) вводится в ство­ловые клетки, позволяет проводить селекцию, направленную против дифферен­цированных клеток при рутинном культивировании, облегчает удаление ингиби­торов и усиливает рост стволовых клеток. Модуляция действия любых ингиби­торов, продуцируемых этими дифференцированными клетками, также улучшает пролиферацию стволовых клеток.

Направленная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в специфические линии пока не достигнута. Спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши, стволовых клеток карциномы и эмбриональных половых клеток человека наблюдается как в эмбриоидных телах, так и в культурах с высокой плотностью. В системах мышиных эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток карциномы человека ретиноевая кислота или полярные ра­створители, факторы роста индуцируют дифференцировку в клеточные популя­ции, обогащенные клетками определенного типа. Набор клеток, обычно наблюда­емый в тератомах после ксенотрансплантации эмбриональные стволовые клетки или стволовые клетки карциномы человека, превыша­ет таковой при рутинной культивации In vitro. Таким образом, и индукция, и про­лиферация клеток-предшественников зависят от факторов окружающей среды, от­сутствующих In vitro, или факторы, присутствующие In vitro блокируют образо­вание определенных клеточных линий.

С другой стороны, разнообразие клеток в культуре может ограничивать сочетание этих двух возможностей. Не исключено, что будет необходима более простая система культивирования клеток, которая ис­ключает эффект фидерного слоя и сывороточный компонент, чтобы вводимый очи­щенный фактор или комбинация факторов управляла превращением стволовых клеток в определенные линии клеток. Селективные условия культивирования или использование селекции линий специфических стволовых клеток может по­зволить выделение чистых популяций клеток-предшественников, появляющих­ся в смеси клеточных типов спонтанной дифференцировки.