Реакция Вассермана

С 1985 г. в комплекс серологических реакций для диагностики всех форм сифилиса включены:

— реакция связывания комплемента (РСК) с кардиолипиновым и трепонемным антигенами,

— микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном.

Эти реакции называются стандартными серологическими реакциями. Изолированно реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном используется в качестве отборочного теста на сифилис.

Комплекс серологических реакций на сифилис применяют не только для диагностики сифилиса, но используют для контроля эффективности лечения, обследования лиц, имеющих половой контакт с больным сифилисом, больных с анамнестическим подозрением на сифилис, а также при профилактических обследованиях доноров, беременных, больных психиатрических и неврологических стационаров, лиц, направляемых на прерывание беременности.

Реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) и реакцию иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) применяют как для диагностики сифилиса, так и для распознавания ложноположительных реакций, полученных в тестах с липоидными ангигенами.

Реакцию связывания комплемента открыли Борде и Жангу и 1901 году, Вассерман, Нейсер и Брик в 1906 году описали эту реакцию применительно к сифилитической инфекции, с тех пор она известна как реакция Вассермана — РВ. Надо отметить, что в ряде стран, например во Франции, реакцию Вассермана обозначают как реакцию BW (Борде-Вассермана).

В качественной реакции связывания комплемента (РСК) на сифилис участвуют следующие ингредиенты: испытуемая инактивированная сыворотка крови, разведенная 1:5, антиген, разведенный по титру, комплемент, разведенный по рабочей дозе, гемолитическая система. Одновременно с исследованием испытуемой сыворотки ставят для контроля реакции с заведомо положительными (4+ и 2+) и отрицательной сыворотками крови.

Испытуемая сыворотка крови

Кровь для исследования берут стерильно в количестве 8-10 мл из локтевой вены натощак. У грудных детей кровь берут из черепных или яремной вен, иногда из разреза на пятке. Можно брать кровь через 6 часов после приема пищи, если больной не употреблял большого количества яиц и жирных продуктов. Не следует брать кровь ранее 24-48 часов после употребления спиртных напитков и жирной пищи или приема препаратов наперстянки, при повышенной температуре, в период инфекционных заболеваний и непосредственно после них, у женщин во время менструаций, у беременных в последние 2 недели перед родами и у родильниц в первые 10 дней после родов, у новорожденных в первые 10 дней жизни.

Практически не пригодны для исследования гемолизированные сыворотки и сыворотки больных желтухой.

Кровь берут сухой стерильной иглой среднего диаметра, собирают в сухую стерильную пробирку. Можно брать кровь шприцем с иглой.

Взятая кровь сразу же направляется в лабораторию. Если это невозможно, она сохраняется в холодильнике при температуре 4 °С не более 48 часов.

Если для выполнения серологических реакций на сифилис на месте нет условий, то в лабораторию пересылают сыворотку крови, предварительно высушенную на полоске целлофана, вощаной или плотной бумаги, или на стекле. Для этого на следующий день после взятия крови из пробирки отсасывают шприцем (сухим или промытым изотоническим раствором натрия хлорида) 1 мл сыворотки и выпускают ее на бумагу или целлофан в двух местах, по 0.5 мл в каждом. На свободном крае бумаги производят маркировку (Ф.И.О. пациента, дату и порядковый номер). После высыхания сыворотки, которая приобретает вид желтой стекловидной пленки, её отсылают в лабораторию.

Исследование высушенной сыворотки не может полностью заменить исследования нативной сыворотки. При постановке РСК на сифилис с высушенной сывороткой наблюдается снижение позитивности реакций.

Следует отметить, что для уничтожения естественного комплемента испытуемую сыворотку инактивируют путем нагревания на водяной бане при температуре 56-58°С в течение 30 минут.

Антигены

Вассерман в качестве антигена применял водный экстракт печени сифилитического плода, содержащей большое количество бледных трепонем. Он считал, что реакция Вассермана строго специфическая реакция. Однако уже через год выяснилось, что и спиртовые экстракты паренхиматозных органов здорового человека могут применяться в качестве антигена в серологических реакциях на сифилис. Через некоторое время оказалось, что спиртовые экстракты органов (сердце, печень и др.) здоровых животных, используемые в реакциях как антигены, дают результаты не хуже, чем антигены печени сифилитического плода. Таким образом, все вышеуказанные антигены не являются специфическими трепонемными, а представляют собой органные антигены,

Холестеринизированные алкогольные экстракты из мышц бычьего сердца, длительное время применявшиеся в качестве антигена (липоидного) в реакции Вассермана не являются полноценными антигенами. Они представляют собой гаптены, обладают низкой чувствительностью и дают относительно высокий процент неспецифических результатов. В последние годы липоидные неспецифические органоэкстрактные антигены практически перестали применять.

В настоящее время пользуются модернизированным липоидным антигеном — кардиолипиновым антигеном, который предложил в 1947 году Пангборн. Кардиолипин получили путем осаждения бария хлоридом спиртового экстракта из бычьих сердец и последующего фракционирования осадка бария хлорида. Кардиолипин активен только в сочетании с лецитином и холестерином.

Так как составные компоненты (фосфолипин, лецитин) кардиолипинового антигена освобождены от балластных нейтральных жиров, этот антиген высоко чувствителен и достаточно специфичен.

Липоидные антигены, не являясь полноценными и специфическими антигенами, дают возможность определять не истинные антитела, а лишь противолипидные реагины. Первые попытки приготовить из культуральных трепонем специфический антиген для серологической диагностики сифилиса делал Н.А. Шерешевский еще в 1909 году.

Протеиновую фракцию из бледных трепонем приготавливают экстракцией раствором калия хлорида или повторным замораживанием и оттаиванием.

Трепонемный антиген (водный трепонемный антиген, полученный разрушением трепонем ультразвуком с добавлением 3% карболовой кислоты) был предложен Готе и Тернером в 1953 году. Ультраозвученный культуральный трепонемный антиген выпускают лиофильно высушенным по 5 и 10 мл во флаконах. Этот антиген содержит протеиновый, полисахаридный и липоидный компоненты.

Чувствительность ультраозвученного трепонемного антигена при поздних формах сифилиса более высока, чем чувствичельносгь протеиновой фракции культуральных бледных трепонем. Однако последний антиген но сравнению с ультраозвученным более специфичен.

Изготовление антигенных препаратов из культуральных. бледных трепонем более просто и экономично, чем приготовление антигенов из патогенных бледных трепонем (из сифилом кроликов) Поэтому в РСК целесообразнее использовать антиген из культуральных бледных трепонем.

Из вышеизложенного видно, что серологические реакции связывания комплемента, применяемые для диагностики сифилиса на практике во все последующие годы после опыта Вассермана, принципиально отличаются по своим антигенам от классической реакции Вассермана.

Однако название «реакция Вассермана» традиционно сохранилось для проводимых диагностических РСК до настоящего времени.

Комплемент — комплексное соединение в основном белковых фракций, способствующее лизису сенсибилизированного клеточного антигена (гемолизу, бактериолизу и т.д.). Его обнаруживают в свежей сыворотке крови, лимфе и тканевых жидкостях человека и животных. В нормальной спинномозговой жидкости комплемента нет.

При употреблении гемолизина к бараньим эритроцитам наибольшей активностью к эритроцитам барана обладает комплемент морской свинки. Комплемент человека значительно менее активен и для постановки реакции не используется, а напротив инактивируется. В РСК в качестве комплемента применяют сыворотку крови морской свинки. Комплемент используют свежим, консервированным (к свежей сыворотке добавляют 4% сухой борной кислоты и 5% натрия сульфата), лиофильно высушенным (в день постановки реакции его растворяют в 1 мл сухого комплемента добавляют 1 мл изотонического раствора натрия хлорида).

Непосредственно перед постановкой реакции проводят титрование комплемента, то есть определяют минимальное количество комплемента, способствующее полному гемолизу добавленного количества сенсибилизированных бараньих эритроцитов.

Гемолитическая система (эритроциты, барана, гемолитическая сыворотка)

Индикатором в РСК, то есть показателем результата исследования, служит реакция гемолиза. В этой реакции в присутствии комплемента участвуют два компонента: эритроциты барана и гемолитическая сыворотка.

В РСК используют эритроциты барана, которые, по сравнению с эритроцитами других животных, не столь хрупкие и более стойкие, не подвергаются быстрому гемолизу при отмывании и при хранении в изотоническом растворе натрия хлорида.

Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана. Ее инактивируют в течение 30 минут при температуре 56°С.

Результаты РСК оценивают в зависимости от наличия или отсутствия гемолиза в опытных пробирках. Наличие гемолиза объясняется тем, что ввиду отсутствия в испытуемой сыворотке сифилитических антител реакция антиген-антитело не происходит, и весь комплемент идет на реакцию бараньи эритроциты-гемолизин. В то время как при наличии специфических антител комплемент полностью уходит на реакцию антиген-антитело, что приводит к задержке гемолиза.

Максимальная позитивность реакции Вассермана обозначается 4+ (резко положительная реакция) и соответствует полной задержке гемолиза, 3+ (положительная реакция) — соответствует значительной задержке гемолиза, 2+ (слабоположительная реакция) — частичной вдержке гемолиза, 1+ (сомнительная реакция) — незначительной вдержке гемолиза. Отрицательная реакция Вассермана характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта.

Качественная РСК дает только некоторое представление о количестве реагинов и антител. Обозначение 4 + остается постоянным независимо от различного максимального их количества.

Количественное определение реагинов и антител имеет значение при оценке результатов противосифилитического лечения. Количественный метод постановки РСК оказывает помощь при дифференциальной диагностике свежего и рецидивного вторичного сифилиса, раннего и позднего скрытого сифилиса, при выявлении неспецифических ложноположительных реакций, но ценность его в данных случаях не абсолютна. Обычно при свежем вторичном сифилисе РСК бывает в высоком, титре, а при рецидивном вторичном сифилисе — в низком. Однако в некоторых случаях наблюдают и обратную зависимость. Низкие титры неспецифических ложноположительных реакций отличают их от специфических реакций. Но это не является правилом, в отдельных случаях отмечается противоположное явление, отмечено очень высокие — 1:320 и даже 1:5120 — титры неспецифических серологических реакций при некоторых заболеваниях несифилитической этиологии.

Количественная методика постановки РСК заключается в использовании уменьшающегося количества испытуемой сыворотки, а в остальном методика реакции остается обычной. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим раствором натрия хлорида в следующих пропорциях: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, а при необходимости — и далее. Титром реагинов исследуемой сыворотки крови является последнее разведение, при котором наблюдается задержка гемолиза.