Определение глюкозы глюкозооксидазным методом

Определение концентрации глюкозы в крови – одно из наиболее часто выполняемых биохимических исследований в лабораториях.

Глюкозооксидазный метод определения глюкозы в крови и моче основанн на реакции окисления глюкозы в присутствии фермента глюкозооксидазы с образованием перекиси водорода, которая в свою очередь в присутствии пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенных продуктов; о концентрации глюкозы сулят по количеству окрашенных продуктов.

Поскольку глюкозооксидазный метод направлен на выявление именно глюкозы, а не всех видов сахаров, его применяют в дифференциальной диагностике следующих заболеваний:

• пентозурия
• непереносимость лактозы
• наследственный синдром непереносимости фруктозы
• изолированная фруктозурия

Принцип глюкозооксидазного метода определения глюкозы

Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляет­ся кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолуидин образованием окрашенного соедине­ния, интенсивность окраски которого пропорциональна содержа­нию глюкозы. Данный метод позволяет определить уровень глюкозы в плазме крови, сыворотке и спинномозговой жидкости.

Нормальное содержание глюкозы в крови, ммоль/л

— в плазме, натщесерце

• новорожденные — 1,7 — 4,2
• дети от 6 недель до 15 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) — 3,9 — 5,6

 — в сыворотке крови, натщесерце

• новорожденные — 2,6 — 4,2
• дети от 6 недель до 2 лет — 3,3 — 5,4
• взрослые (мужчины, женщины) —  3,9 — 5,6

Необходимые реактивы для определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Натрия хлорида 9 грамм/литр(изотонический раствор): готовят, раст­воряя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.

2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворя­ют в воде, объем доводят до 100 мл.

3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).

4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодиль­нике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имею­щийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.

5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa X ЗН2О в 1 литре).

6. Глюкозооксидаза — сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.

7. Пероксидаза из хрена. 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить не­сколько дней.

8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начи­нает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточ­но чистый и его надо перекристаллизовать.

9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предваритель­но высушивают при температуре 37°С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раство­ра (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает расчеты при калибровке.

Ход определения глюкозы глюкозооксидазным методом

В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гид­рата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровоч­ного раствора, снова перемешивают и через 10 минут центрифуги­руют при скорости 3000 об./мин в течение 10 минут.

К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реак­тива и осторожно перемешивают.

Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13-15 минут, а затем постепенно умень­шается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 сантиметр с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия.

При приготовлении калибровочного гра­фика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.

Расчет уровня глюкозы можно проводить по правилу пропорций или по калиб­ровочному графику, для построения которого на одной оси откла­дывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой — величи­ну экстинкции.

Примечания к методика определения глюкозы глюкозооксидазным методом

1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотониче­ский раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфа­та цинка и NaOH.

2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно еже­дневно обрабатывать холостую пробу и 2-3 точки в диапазоне 3-9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.