Криоконсервация спермы человека

Хирургическое, медикаментозное и лучевое ле­чение злокачественных опухолей у детей и взрослых все чаще спасает жизнь больных. Даже в тех слу­чаях, когда полное излечение невозможно, адекват­ная терапия замедляет развитие рецидивов.

В связи с этим все большее значение приобретают длитель­ные вредные эффекты самих лечебных мероприя­тий.

Химио- и лучевая терапия, равно как и хирурги­ческие вмешательства, резко и подчас необратимо нарушают мужские половые функции. Степень таких нарушений зависит от вида лечения, характера и до­зировок применяемых средств.

Криоконсервация сперматозоидов, полученных перед началом лечения, сохраняет для он­кологических больных возможность продолжения рода.

Ниже рассматриваются современные методы криоконсервации сперматозоидов человека. Врачи и другие работники здравоохранения должны учи­тывать отдаленную перспективу качества жизни па­циента в отношении его фертильности и планирова­ния семьи и обсуждать эти вопросы еще перед нача­лом основного лечения.

История криоконсервации сперматозоидов человека

О сохранении подвижности сперматозоидов по­сле их замораживания и оттаивания первым сооб­щил Спаланцани в 1776 г. В середине XIX в. возникла идея хранения сперматозоидов, используемых для размножения скота.

Примерно тогда же рассматри­валась возможность замораживания сперматозои­дов солдат, чтобы в случае их гибели на войне жены могли бы родить от них ребенка. Серьезная разра­ботка методов криоконсервации сперматозоидов началась в первой половине XX в.

Существенный прогресс обеспечило приме­нение первого криопротектора — глицерина, защи­щающего и сохраняющего функции сперматозоидов при замораживании. Уже вскоре появилось первое сообщение об успешном оплодо­творении и индукции беременности с помощью криоконсервированных сперматозоидов.

Анализ и подготовка проб сперматозоидов к криоконсервации

Эякулят после разжижения анализируют в соот­ветствии с рекомендациями ВОЗ, проводят спермограмму. Возможность использования сперматозоидов для искусственного оплодотворения во многом зависит от их концентрации и общего количества в эякуляте, морфологии и подвижности.

Интактность мембраны клеток можно оценить с помощью теста на набухание в гипоосмотической среде, хотя его результаты не позволяют прогнозировать качества оттаявших по­сле замораживания сперматозоидов.

Процент жизнеспособных сперматозоидов после криоконсервации определяют с помощью эозинового теста. Предварительный отбор подвижных клеток методом флотации не улучшает их качества после за­мораживания. Исследование эякулятов здоровых добровольцев показало, что модификация техники криоконсервации и предварительная флотационная селекция сперматозоидов обеспечивает лучшую морфологию клеток после их оттаивания. Пока неясно, сказывается ли та­кое улучшение на результатах искусственного опло­дотворения у человека.

Резкий перепад температуры в процессе замора­живания изменяет агрегационные свойства вне- и внутриклеточной среды сперматозоидов, нарушая структуру и функцию клеток.

Дегидратация сперма­тозоидов сопровождается их сморщиванием, а обра­зование снаружи и внутри кристаллов льда наруша­ет электролитный баланс и проницаемость клеточ­ной мембраны.

Ледяные кристаллы вызывают повреждение вну­триклеточных структур и гибель клеток. Поэтому к эякуляту перед замораживанием добавляют криопротекторные среды. Они состоят либо из смеси яич­ного желтка с глюкозой или фруктозой, либо из спе­циальной среды, сывороточного альбумина человека и глицерина с добавкой калликреина. Эти среды пре­пятствуют сморщиванию клеток, влияя на обмен ио­нов, и уменьшают образование кристаллов льда (на­пример, глицерин и сорбитол, проникающие сквозь мембрану сперматозоидов). Не проникающие в клет­ки криопротекторы (например, сывороточный альбу­мин человека с добавками препаратов яичного жел­тка) связываются с клеточной мембраной и стабили­зируют ее.

Для защиты сперма­тозоидов при замораживании применяли антиоксиданты (витамин Е), вещества, связывающие ионы кальция (ЭДТА), а также производные фосфатидилхолина (фактор, активирующий тромбоциты) или метилксантина (пентоксифиллин). Подвижность сперматозои­дов после оттаивания пытаются улучшить и путем из­менения концентраций добавляемых веществ.

Методики криоконсервации

После разжижения при 37°С стерильный эякулят тщательно смешивают с равным объемом криопротекторной среды (например, SteritecTM, Steripharm, Берлин, Германия; TEST-Yolk buffer, Irvune Scientific, Ирвайн, Калифорния, США). Разведенную пробу в стерильных условиях переносят в пластмассовые пробирки объемом не более 300 мкл каждая, кото­рые обеспечивают оптимальное распределение тем­пературы при охлаждении. В специальном «криопланшете» может храниться максимум 12 пробирок. Морозильники с компьютерным программированием (например, Planer Kryo 10-Serie И, Messer Griesheim, Крефельд, Германия; ICEcubeTM 1810, Tec-Lab, Xeдель, Нидерланды) позволяют стандартизовать тем­пы замораживания.

Во избежание сморщивания клеток, осмотиче­ского их повреждения и образования ледяных кри­сталлов необходимо строго соблюдать соответствие темпов замораживания и оттаивания. Охлаждение обычно производят постепенно. Наружные кристаллы льда начинают образовываться вскоре после достижения 0°С (примерно при -5°С), а внутри клеток — при -15-80°С. Общих правил относительно скорости охлаждения от 0°С до -80°С не существует. Слишком быстрое охлаждение сопро­вождается сморщиванием клеток вследствие их де­гидратации, а слишком медленное — образованием ледяных кристаллов. В большинстве случаев при криоконсервации спермы человека замораживание проб производят со скоростью от 8 до 21°С в минуту. По достижении -19б°С пробы хранят в жидком азоте.

Скорость последующего оттаивания проб должна соответствовать скорости их замораживания. Рекомендуется использовать морозильник, в котором пробы охлаждаются до -196°С, а оттаивание происходит по обратной программе. В некоторых лабораториях оттаивание производят при комнатной температуре или с помощью водяной бани, нагретой до 37°С. Более целесообразно оттаивать небольшую аликвоту пробы, чтобы оценить подвижность сперматозоидов. Это может оказаться полезным при последующем использовании таких клеток для искусственного оплодотворения.

Сперматозоиды, полученные хирургическим путем (из придатка или самого яичка), помещают в специальную среду для дальнейшей обработки, смешивают с криопротекторами и, наконец, замораживают и хранят в жидком азоте. В разных лабораториях используют разные емкости для хранения. Пробы из придатков яичек обычно хранят в описанных выше пробирках, тогда как для проб из самих яичек используют меньшие емкости, подходящие для стерильной криоконсервации.

Хранение замороженных образцов сперматозоидов

О качестве сперматозоидов после длительного хранения замороженных проб известно очень мало. Показано, что хранение дольше 36 месяцев приводит к снижению подвижности клеток. Однако систематических или проспективных исследований, в которых оценивалось бы влияние стандартизированной криоконсервации на сохранность качества сперматозоидов при их длительном хранении, не существует. До сих пор исследовались лишь сперматозоиды здоровых доноров, и полученные результаты нельзя полностью переносить на клетки онкологических больных, неполноценные даже до начала противоопухолевой терапии.

Большинство онкологических больных после крионсервации их эякулятов подвергаются агресивной химио- или радиотерапии. Поэтому использовать их сперматозоиды для искусственного оплодотворения следует лишь через некоторое время по окончании лечения. Чтобы убедиться в эффективности терапии и в возможности планирования семьи в таких случаях нужно ждать, вероятно, не менее пяти лет. Шансы на возникновение беременности при ис­кусственном оплодотворении криоконсервированными сперматозоидами в таких случаях оценить трудно. Зачатие и рождение детей наблюдалось при использовании сперматозоидов, хранившихся в за­мороженном состоянии до 9 лет. Таким образом, са­мо по себе время хранения практически не влияет на возможность использования замороженных сперма­тозоидов.

Замороженные пробы можно длительно хранить в тех же лабораториях, где производят криоконсервацию. Необходимо обеспечить постоянство темпе­ратуры хранения; контейнеры с жидким азотом нель­зя открывать повторно. Хранить сперматозоиды можно и в коммерческих холодильных установках. Больные могут ежегодно подписывать контракты с организацией, осуществляющей эту процедуру. Ми­нимальная стоимость хранения замороженных спер­матозоидов в Германии составляет примерно 300 ев­ро и обычно оплачивается самим пациентом. Страхо­вые агентства берут на себя расходы лишь в исклю­чительных случаях. При использовании спермато­зоидов для искусственного оплодотворения пробы по запросу пациента направляется врачу.

Показания к криоконсервации сперматозоидов

Криоконсервация сперматозоидов сохраняет возможности продолжения рода для лиц со зло­качественными заболеваниями. Совершенствование методов диагностики и лечения позволяет спасать жизнь все большему числу молодых людей с онкологическими заболеваниями, например, с опухолями яичек, болезнью Ходжкина или лейкемией.

Эти заболевания возникают в большинстве слу­чаев в том возрасте, когда репродуктивный период еще не начался или не завершился, т.е. тогда, когда половая функция в значительной мере определяет качество жизни человека. Из 681 онкологического больного (средний возраст 28 лет), сдавшего между 1987 и 1999 гг. свою сперму для криоконсервации, только 183 (27%) до болезни успели жениться и только 86 (12%) имели детей.

Степень нарушения функции гонад при химио- или радиотерапии невозможно предсказать заранее, а шансы на восстановление их функции зависит от самой лечебной процедуры, используемых доз и индивидуальной чувствительности больного. Надежно защитить гонады от повреждающего дей­ствия химио- и радиотерапии до сих пор не удается. Если ретроградная эякуляция после забрюшинной лимфаденэктомии поддается некоторым лечебным мероприятиям, то полную импотенцию после ради­кальных операций (например, простатэктомии) из­лечить невозможно.

Профилактическая криоконсервация спермы — шанс избежать вредного влияния лечебных меро­приятий на фертильность, что может поддержать ду­шевные силы молодых людей в тяжелейшей психо­логической ситуации. Большинство лиц, решающих сдать сперму для криоконсервации, страдают злока­чественными заболеваниями. Другие прибегают к этому из-за неясности диагноза или из-за возможно­го вредного действия терапии на функцию яичек при доброкачественных заболеваниях (данные отображены в следующей таблице).

Частота криоконсервации спермато­зоидов по разным показаниям 

Диагноз	Число больных, %
Опухоли яичек	377 (52)
Болезнь Ходжкина/ неходжскинская лимфома	143 (20)
Лейкозы	63 (9)
Костные опухоли	50 (7)
Другие злокачественные заболевания	48 (7)
Доброкачественные заболевания	37(5)

В данном случае проводится замораживание в среднем по 2-3 про­бы сперматозоидов от каждого пациента.

В последние годы все большее значение прио­бретает криоконсервация сперматозоидов, получае­мых хирургическим путем. При невосстановимой об­струкции семенных путей и первичной тестикуляр­ной недостаточности экстракция сперматозоидов из придатков или самих яичек с последующей криоконсерваций этих клеток становится обычной процеду­рой в центрах репродуктивной медицины.

Криоконсервация сперматозоидов играет все большую роль при разработке внутренних и внешних систем контроля качества в андрологии.

Онкологические заболевания у взрослых

Известно, что при опухолях яичек и других зло­качественных заболеваниях (например, болезни Ходжкина, лейкозе) функция яичек нарушается. Од­нако причины снижения фертильности при злока­чественных заболеваниях остаются неясными. Среди больных олиго-астено-зооспермия до криоконсервации обнаруживалась у 60% мужчин с опухолями яичек, у 44% с лимфолейкозами и у 35% с различными солидными опухолями . Азооспермия имела место у 34 больных, концентра­ция сперматозоидов ниже 1 млн/мл — у 73, и у 299 больных их концентрация оставалась нормальной. Снижение концентрации сперматозоидов — не са­мый важный фактор прогноза успешности искус­ственного оплодотворения.

Замораживание особенно сказывается на по­движности сперматозоидов . Хотя у онко­логических больных этот показатель и без того со­ставляет в среднем 40% от нормы, сразу же после от­таивания он падает почти до 16%, причем независи­мо от характера патологического процесса и возра­ста больных. Чем выше была подвижность сперматозоидов перед замораживанием, тем более высо­кой она сохранялась и после оттаивания. Этот пока­затель считается одним из важных параметров, опре­деляющих успех инсеминации и экстракорпорально­го оплодотворения. Поэтому частую неэффективность соответствующих процедур можно объяснить снижением подвижности сперма­тозоидов вследствие замораживания. Однако для интрацитоплазматической инъекции сперматозои­дов (ИКСИ) доля подвижных клеток не столь важна. При этой процедуре подвижность сперматозоидов служит лишь индикатором их жизнеспособности, по­зволяющим отбирать для инъекции живые клетки.

Онкологические заболевания у детей

Криоконсервацию спермы можно применять и у молодых людей со злокачественными заболевания­ми. Параметры спермы до и после ее криоконсерва­ции у мальчиков 14-17 лет сравнимы с таковыми у 18-летних юношей независимо от характера опухоли. Хотя у детей используют менее агрессивные методы химиотерапии, прогнозировать ее влияние на функцию гонад в будущем (которое зависит от конкретного сочетания химиотерапевтических средств) трудно. Неалкилирующие агенты (адриамицин, винкристин, метотрексат) вызывают постоянную азооспермию почти у 16% больных де­тей.

При применении цисплатина азооспермия разви­вается у 37% детей, а при введении алкилирующих агентов (циклофосфамида или прокарбазина) бес­плодие возникает у 68% больных. Неизвестно, можно ли использовать ткань яичек, взятую у больных препубертатного воз­раста до начала лечения, для последующей ретрансплантации с целью восстановления фертильности. Пока делаются лишь первые экспериментальные по­пытки трансплантации зародышевых клеток.

При консультировании очень молодых больных и их родителей до начала потенциально токсичного для гонад лечения следует обсудить возможность криоконсервации сперматозоидов, что могло бы способствовать улучшению качества дальнейшей жизни, включая перспективу отцовства.

Криоконсервация перед вазэктомиеи и после вазовазостомии

Для мужчин не существует гормональных средств обратимой контрацепции, подобных женским пилю­лям. Поэтому в случаях предстоящей вазэктомии можно рассмотреть возможность криоконсервации сперматозоидов.

Вазэктомия — инвазивное вмешательство, часто приводя­щее к необратимому бесплодию. Есте­ственно, все решения, относящиеся к планированию семьи, решает супружеская пара. Однако нередко внезапно изменившиеся обстоятельства (смерть ре­бенка или жены, повторная женитьба) заставляют мужчину пожалеть о ранее принятом решении и об­ратиться к хирургу с просьбой о реконструктивной операции (вазовазостомии или вазоэпидидимостомии). В таких случаях криоконсервация спермы и по­следующее искусственное оплодотворение могли бы обеспечить возможность отцовства. Даже успешная вазовазо- или вазоэпидидимостомия не исключают послеоперационной обструкции семенных протоков.

Поэтому сперматозоиды, полученные путем аспира­ции в ходе операции или из первых эякулятов после восстановления фертильности, целесообразно сох­ранять в замороженном виде. Получить в ходе опе­рации подвижные сперматозоиды, которые можно было бы впоследствии использовать для ИКСИ, удается примерно у трети пациентов. Предварительно следует обсудить с пациентом финансовые вопросы.

Криоконсервация у больных с повреждениями спинного мозга

Меньшее внимание в этом плане уделяют неболь­шой группе больных с повреждениями спинного моз­га. До 95% таких больных теряют способность к эя­куляции. Путем ректальной электростимуляции у них все же можно получить эякулят и использовать спер­матозоиды для искусственного оплодотворения. По­скольку электростимуляция — процедура тягостная, требующая междисциплинарного подхода и во мно­гом зависящая от доверительных отношений между больным и врачами, криоконсервация полученных сперматозоидов создает лучшие условия для после­дующего искусственного оплодотворения.

Криоконсервация образцов, полученных путем MESA и ТЕSЕ

В тех случаях обструктивной азооспермии, когда реконструкция семенных путей (вазовазо- или вазо­эпидидимостомия) невозможна, сохраняется шанс на получение сперматозоидов путем их микрохирур­гической (MESA) или, иногда, чрескожной аспирации из придатка яичка. К этой группе принадлежат паци­енты с постинфекционной обструктивной азооспер­мией, с врожденной двусторонней аплазией семявы­носящих протоков или с аномалиями придатков яи­чек. Полученные таким об­разом сперматозоиды можно заморозить и использо­вать в дальнейшем для искусственного оплодотворе­ния. Криоконсервация сперматозоидов в этих слу­чаях избавляет пациентов от повторных операций. Опыт показывает, что для ИКСИ пригодны как све­жие, так и предварительно замороженные клетки из придатков яичек. Однако известно, что подвижность эпидидимальных сперматозоидов после оттаивания значительно снижается, и вероятность беременности при их использовании меньше, чем при оплодотворе­нии свежими клетками.

У лиц с тяжелой олиго-астено-зооспермией и гипергонадотропной азооспермией вследствие Сертоли-клеточного синдрома или с неполной блокадой сперматогенеза сперматозоиды для ИКСИ можно эк­страгировать из ткани яичек (TESE), полученной хи­рургическим путем.

Неиспользованную ткань яичек следует замо­розить, с тем чтобы извлечь из нее сперматозоиды для последующих циклов искусственного оплодотво­рения. В последние годы показано, что экстракция сперматозоидов даже из предварительно заморо­женной ткани яичек создает возможность отцовства для лице азооспермией. Сперматозоиды из ткани яи­чек удается получить почти у 70% мужчин с азо­оспермией.

Вероятность бере­менности, индуцированной такими клетками, в раз­ных центрах варьирует от 10 до 30% и зависит в ос­новном от тяжести нарушений сперматогенеза. Шансы на оплодотворение и бере­менность при использовании зародышевых клеток из яичек значительно возрастают, если в осадке эя­кулята все же присутствуют одиночные сперматозои­ды.